HPLC là gì?
 Sơ đồ nguyên lý cơ bản hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một dạng sắc ký lỏng cột được cải tiến, thay vì dung môi chảy dưới áp suất của trọng lực, dung môi chảy với áp suất cao lên tới 400 atm, làm tăng tốc độ chảy của dung môi pha động. HPLC hoạt động với nguyên tắc cơ bản: tách một mẫu gồm hỗn hợp thành phần thành các bộ phận cấu thành của nó dựa trên sự khác biệt về ái lực giữa các phân tử khác nhau với pha động và pha tĩnh được sử dụng trong quá trình tách. Phân loại Trong sắc ký HPLC phân loại dựa trên cơ chế tách của pha tĩnh có các loại sau:1. HPLC thuận (NP-HPLC) Sắc ký pha thuận sử dụng pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực. Pha tĩnh thường là silica, Pha động điển hình là hexane, methylene clorua, chloroform, dietyl ete và hỗn hợp các chất này. Các chất phân cực được giữ lại trên bề mặt cực của cột pha thuận lâu hơn, các chất không phân cực ra khỏi cột trước .2. HPLC pha đảo (RP-HPLC) Pha tĩnh không phân cực (kỵ nước), trong khi pha động là chất lỏng phân cực, ví dụ hỗn hợp nước và metanol hoặc acetonitril. Ngược lại với pha thuận, các chất không phân cực được giữ trên cột pha đảo lâu hơn nên ra ra khỏi cột sau.Các chất phân cực đi ra cột trước.3. HPLC rây phân tử Cột được nhồi bằng các vật liệu có kích thước lỗ rỗng chọn lọc chính xác và các hạt được phân tách theo kích thước phân tử của nó. Các phân tử lớn hơn nhanh chóng được rửa qua cột; các phân tử nhỏ đi qua các lỗ rỗng của hạt nên đường đi lâu hơn và đi ra cột lâu hơn4. HPLC trao đổi ion Bề mặt pha tĩnh được phủ bởi các điện tích ion tích điện trái dấu với các ion mẫu. Kỹ thuật này được sử dụng gần như độc quyền với các mẫu ion hoặc ion hóa.Điện tích trên mẫu càng mạnh thì sẽ bị hút mạnh hơn vào bề mặt ion và do đó, nó sẽ được lưu giữ với thời gian hơn để rửa giải. Pha động là các dung dịch đệm, được kiểm soát cả pH và cường độ ion. Cấu tạo của hệ thống HPLC 2. Bơm - Bộ phận phân phối dung môi Bơm pittong hút pha động từ bình dung môi đẩy vào hệ thống qua các bộ phận tiêm mẫu, cột và đầu dò sau đó qua bình đựng dung môi thải. Tuỳ thuộc vào các cấu hình hệ thống (ví dụ kích thước cột, kích thước hạt của pha tĩnh, tốc độ chảy và thành phần của pha động) áp suất vận hành ở 6000psi (413 bar) có thể lên tới 18 000 psi (1240 bar).3. Bộ tiêm mẫu Bộ phận tiêm mẫu có thể là bộ phận tiêm mẫu tự động hoặc tiêm mẫu bằng tay có bộ phận kim phun. Kim phun mẫu cho hệ thống HPLC sẽ cung cấp việc tiêm mẫu chất lỏng trong phạm vi 0,1-100 mL thể tích với độ tái lập cao và dưới áp suất cao (lên đến 18 000 psi).4. Cột Cột phân tích thường được làm bằng thép không gỉ, dài từ 50 - 300 mm và có đường kính trong từ 2 - 5 mm. Thông thường, Cột được nhồi bằng các hạt silica / silica lai có kích thước từ 2,5 – 10 m. Trong quá trình hoạt động, nhiệt độ của pha động và cột nên được giữ ổn định trong quá trình phân tích. Vì vậy trong thực tế, các hệ thống có thêm buồng điều nhiệt cột.5. Đầu dò - Detector Detector nằm ở cuối cột có nhiệm vụ phát hiện các chất phân tích khi chúng được rửa giải từ cột sắc ký. Các đầu dò thường được sử dụng là máy UV-VIS, huỳnh quang, khối phổ, tán xạ bay hơi…6. Thiết bị thu thập dữ liệu Tín hiệu từ đầu dò có thể được thu thập trên máy ghi biểu đồ hoặc bộ tích hợp điện tử khác nhau với các phần mềm lưu trữ, phân tích và xử lý dữ liệu sắc ký. Các ứng dụng của HPLC Thông tin thu thập được qua hệ thống HPLC bao gồm độ phân giải, định lượng hợp chất. HPLC cũng hỗ trợ trong việc tách hóa chất và tinh chế. Ngoài ra, sử dụng HPLC trong các ứng dụng bao gồm:Ứng dụng dược phẩm 1. Để kiểm soát sự ổn định của thuốc. 2. Nghiên cứu dược động học của các dạng bào chế dược phẩm. 3. Kiểm soát chất lượng dược phẩm.Ứng dụng môi trường 1. Phát hiện các hợp chất phenolic trong nước uống. 2. Theo dõi sinh học các chất ô nhiễm.Ứng dụng trong Pháp y 1. Định lượng thuốc trong mẫu sinh học. 2. Xác định steroid trong máu, nước tiểu, … 3. Phân tích về thuốc nhuộm ngành dệt . 4. Xác định cocaine và các loại thuốc khác trong máu, nước tiểu…..Ứng dụng trong Thực phẩm 1. Định lượng chất lượng nước giải khát và nước. 2. Phân tích đường trong nước ép trái cây 3. Phân tích các hợp chất đa vòng 4. Phân tích chất bảo quảnỨng dụng trong xét nghiệm lâm sàng 1. Phân tích nước tiểu, phân tích kháng sinh trong máu. 2. Phân tích bilirubin, biliverdin trong rối loạn gan.3. Phát hiện Neuropeptide nội sinh trong dịch ngoại bào của não...
Nguồn: Introduction to HPLC, Shimadzu, LC World Talk Special Issue Volume 1 Sắc ký pha thường (Normal-phase Chromatography)Ngày nay, sắc ký pha đảo là phương pháp phân tách HPLC thông dụng nhất, trong khi sắc ký pha thường chỉ giới hạn trong một số ứng dụng. Những lợi ích khác nhau của sắc ký pha thường gồm có ứng dụng mở rộng của nó đối với sự khó khăn trong việc phân tích các hợp chất ion, nhờ có sự phát triển của sắc ký pha đảo ghép cặp ion, và dễ vận hành, như pha động với thành phần chính là nước có thể được sử dụng. Tuy nhiên, sắc ký pha thuận cung cấp nhiều đặc tính khác biệt so với những phương pháp phân tách khác-gồm cả sắc ký pha đảo, và nó có thể cực kì hữu dụng trong một số trường hợp. Sắc ký pha thường là gì? Trước đây, sắc ký pha thường được định nghĩa là một loại sắc ký phân bố trong đó độ phân cực của pha tĩnh lớn hơn so với độ phân cực của pha động. Hơn nữa, sắc ký hấp phụ, được phân loại thành phương pháp phân tách dạng “sắc ký rắn-lỏng”1, ngày nay cũng được xem là một kiểu sắc ký pha thường. Trong hầu hết các trường hợp, pha tĩnh trong sắc ký pha thường là cột silica gel xốp chưa qua xử lý hóa học [vẫn còn 100% nhóm chức silanol] (cột SIL) hoặc cột chứa silica gel biến tính hóa học, gắn trên bề mặt các nhóm chức phân cực như -aminopropyl (cột NH2) hoặc -cyanopropyl (cột CN). Pha động thường được sử dụng gồm ethanol hoặc một dung môi phân cực khác pha lẫn một dung môi không phân cực như n-hexane. Tuy vậy, đôi khi cần sử dụng pha động chứa thêm nước để phân tích những chất phân cực mạnh. Khả năng phân tách đối với mỗi thành phần khác nhau tùy theo hệ số phân bố giữa pha động và pha tĩnh. Tương tác giữa pha tĩnh và những hợp chất mục tiêu xuyên suốt quá trình sắc ký pha thường chu yếu là tương tác ưa nước, còn có cả tương tác bởi liên kết hydrogen và tương tác tĩnh điện. Chính vì thế, sắc ký pha thường cung cấp độ chọn lọc phân tách khác hẳn sắc ký pha đảo (chủ yếu dựa trên tương tác kỵ nước). Sắc ký pha thường được dùng để làm gì? Sắc ký pha thường có thể phân lập một cách dễ dàng những đồng phân của hợp chất tocopherol, khó có thể thực hiện bởi sắc ký pha đảo, và phân tách các hợp chất đường, khó giữ lại trên cột của sắc ký pha đảo. Phương pháp này có thể rửa giải đồng loạt các thành phần với các nhóm thế alkyl có độ dài và phân nhánh khác nhau trong quá trình phân tích các hợp chất loại alkyl benzene sulfonate. Như đã nói ở trên, các đặc tính của những vùng lưu giữ chất cần phân tích khác với sắc ký pha đảo [cơ chế hoạt động pha tĩnh của hai phương pháp sắc ký khác nhau]. Hơn nữa, vì trong sắc ký pha thường dung môi thường không chứa nước nên kĩ thuật này là lý tưởng cho việc phân lập những hợp chất dễ bị thủy phân như acid anhydride; cho việc cô đặc sản phẩm sau quá trình phân đoạn từ sắc ký; hoặc dành cho yêu cầu làm khô của sắc ký điều chế và tinh chế. Sắc ký pha thường còn có thể có ích khi nhìn từ góc độ hiệu suất lượng tử trong phương pháp phát hiện huỳnh quang, hệ số hấp thu quang mol và bước sóng phát hiện trong phương pháp phát hiện đo độ hấp thu quang. Nghiên cứu về sự phân tách bằng sắc ký pha thường Với sắc ký pha thường, việc tăng độ phân cực của pha động thường tăng tốc độ rửa giải. Ví dụ, nếu một hỗn hợp n-hexane và ethanol được dùng làm pha động, sự rửa giải trở nên nhanh hơn nếu tỉ phần ethanol, có độ phân cực cao hơn, tăng lên. Cần lưu tâm rằng mối liên hệ này hoàn toàn trái ngược với sắc ký pha đảo (tốc độ rửa giải tăng khi độ phân cực của pha động giảm). Việc sử dụng pha động là một dung môi có độ nhớt thấp đôi khi cho phép đạt tốc độ dòng chảy cao và sự cân bằng cột diễn ra nhanh chóng. Trong trường hợp cột NH2 hoặc cột CN được dùng, một vài thành phần trong pha động dẫn đến độ phân cực của pha động ngược với pha tĩnh, điều đó làm cho cột sắc ký khi này thể hiện chức năng như một cột sắc ký pha đảo. Vì thế, điều quan trọng là phải nhận thấy được khả năng rằng động thái rửa giải có thể thay đổi mạnh bất thường, đặc biệt khi sử dụng pha động chứa phần lớn là nước. Kết luận Sắc ký pha thường là một kĩ thuật phân tách quan trọng đối với một vài trường hợp. Nó gần như chắc chắn có thể tiếp tục được sử dụng trong một khoảng giới hạn mục tiêu phân tích. Chú thích1Có nhiều cách phân loại sắc ký khác nhau như phân loại theo bản chất vật lý các pha, phương tiện giữ pha tĩnh, cơ chế tách,..Theo bản chất vật lý các pha: sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography, LLC), lỏng-rắn (liquid-solid chromatography, LSC), khí-lỏng (gas-liquid chromatography, GLC), khí-rắn (gas – solid chromatography, GSC)Theo cơ chế tách: sắc ký hấp phụ, phân bố, ái lực, rây phân tử, trao đổi ion,…Theo phương tiện giữ pha tĩnh: sắc ký trên cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy,..Thuật ngữNormal phase chromatography: Sắc ký pha thường (hoặc sắc ký pha thuận) >< Reversed phase chromatography: Sắc ký pha đảoPartition chromatography: Sắc ký phân bốDistribution ratio: Hệ số phân bốHydrophilic interaction: Tương tác ưa/ái nước >< Hydrophobic interaction: Tương tác kỵ nướcXem thêm các bài viết khác theo mục lục tại đây: https://trinhhaithang.wordpress.com/2016/09/07/tai-lieu-co-ban-huu-ich-ve-hplc-dich-thuat/ |
